در روشهای آماده سازی نمونه ، رسوب دادن پروتئین ها به عنوان یک مرحله اختیاری تلقی می گردد . این روش برای جدا کردن انتخابی پروتئین ها از مواد آلاینده و تداخل کننده در محلول مانند نمک ها ، دترجنت ها ، اسیدهای نوکلئیک ، و غیره به کار گرفته می شود . از این روش برای تغلیظ پروتئین های موجود در یک نمونه که در حالت عادی بسیار رقیق باشند ، نیز استفاده می شود .
باید توجه داشت که هیچ روش رسوب دهی به طور کامل کارامد نیست و برخی از پروتئین ها بعد از رسوب داده شدن ، مجددا محلول نمی شوند . به همین دلیل بسته به هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی استفاده کردن از این روش را در دستور کار می توان قرار داد . در صورتیکه هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی به دست آوردن کاملترین نمایه دو بعدی یک نمونه باشد ، باید از انجام رسوبدهی صرف نظر کرد .
جزء به جزء کردن نمونه(Fractionation)
پروتئین هایی که در بافتهای اوکاریوتی بیان می شوند ، از گوناگونی بسیاری برخوردار بوده ، و دارای محدوده دینامیک (محدوده غلظت پروتئین های داخل یک نمونه بین کمترین تا بیشترین غلظت(Range Dynamic) ) وسیعی هستند . برخی از مواقع در نمونه هایی این چنین ، به منظور کاهش پیچیدگی نمونه و افزایش تعداد پروتئین هایی که دارای نسخه پایین هستند ، نمونه جزء به جزء می شود . می توان از روشهای متفاوتی مانند جزء به جزء کردن اجزاء سلولی (Sub-Cellular Fractionation) ، الکتروفورز در فاز مایع ، کروماتوگرافی جذبی و رسوبدهی انتخابی بهره برد . استخراج پی در پی (Sequential Extraction) پروتئین ها از یک سلول یا بافت بر اساس حلالیت آنها در دسته ای از بافر ها که قدرت و خاصیت محلول سازی آنها به تدریج افزایش پیدا می کند ، روش دیگری از جزء به جزء کردن است .
زمانی که قسمتی از پروتئین های سلول یا بافت مورد نظر باشد ، می توان در حین آماده سازی ، نمونه را نیز جزء به جزء کرد . اگر پروتئین هایی از یک قسمت زیر سلولی خاص مورد نظر باشند ، برای مثال ریبوزوم ها ، می توان ارگانل مورد نظر را توسط سانتریفوژ کردن تمایزی در شیبهای سوکروز جدا نمود . اگر چه این روشها را می توان در سلولهای پستانداران که معمولا دارای جداره سلولی ضعیفی هستند ، نیز به کار برد ، اما دسترسی به اورگانل ها در میکرواورگانیسم های دیگر بسیار مشکل است ، زیرا یک روش لیز کردن برای شکستن کارامد دیواره سلولی مورد نیاز است که در عین حال نباید آنقدر خشن باشد که باعث از بین رفتن ارگانل و تخریب آن شود .
رسوبدهی انتخابی بعضی از کلاسهای پروتئینی توسط استن-TCA صورت می گیرد . دیگر روش ، روشهای عصاره گیری متوالی با بافرهایی که به تدریج قدرت محلول سازی آنها افزایش می یابد ، است . مثلا بافرهای مائی ، حلالهای آلی نظیر اتانول ، کلروفورم و اتانول و محلول های حاوی دترجنتهای مختلف . بالاخره روشهای جداسازی کروماتوگرافی ، الکتروفورز در فاز مائی نیز در جزء به جزء کردن نمونه ها بر اساس خصوصیات فیزیکوشیمیایی متفاوت پروتئینهای موجود در نمونه قابل انجام هستند . تصمیم در انتخاب هر یک از این روشها بستگی به ماهیت نمونه و هدف از کار با نمونه دارد .
روشهای جزء به جزء کردن ، ممکن است مزایای بسیاری در غنی سازی پروتئین ها داشته باشند ، اما اصلی ترین نکته منفی در استفاده از این روشها ، این است که بسیار زمانگیر و بسیار پیچیده اند . همچنین نمی توان در یک زمان چند نمونه را وارد این مرحله از کار نمود . اما مزیت اصلی آن ،تعیین جایگاه پروتئین ها از نظر ساختمانی در زیر ساختار سلولی و تعیین عملکرد آنها است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
در روند تخلیص ، خلوص ، مقدار ، حفظ اکتیویتی پروتئین و اقتصادی بودن شرایط مالی و زمانی بسیار مهم است . خلوص مورد نیاز باید از بررسی نوع منابع مادی ، تعیین نوع استفاده از فراورده نهایی ، و ایمنی آن تعیین شود . برای مثال اختلاف بین آلودگی هایی که باید از نمونه برداشته شود و آلودگی هایی که می تواند در آن باقی بماند ، مهم است . فاکتورهای دیگری هم هستند که تأثیر گذارند . بازده بالا معمولا یک کلید مهم است . همچنین زمان پروسه با یک Assay آهسته ما را به کمترین بهره وری سوق می دهد . همه اطلاعات ما درباره خصوصیات پروتئین هدف و آلودگی های آن ، به ما در طی روند تخلیص کمک می کند و به ما اجازه می دهد ، سریعترین و راحت ترین تکنیک ها را انتخاب کرده و بهره وری بالایی داشته باشیم و از وضعیتی که ممکن است پروتئین هدف غیرفعال شود ، احتراز کنیم .
ایجاد یک تست Assay سریع و قابل اطمینان و تعیین فعالیت پروتئین ، برای ادامه پیشرفت در روند تخلیص ، ضروری است . ( بازده ، فعالیت بیولوژی ، بازیافت )
ادامه مطلب مخصوص اعضاء
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در سه شنبه 28 دی 1389برچسب:تخلیص پروتئین ها,
در ساعت8:53 | |
تخلیص پروتئین ها ( بخش اول )
مقدمه
پیشرفت تکنیکها و روشها برای تخلیص پروتئینها ، برای پیشرفت بیوتکنولوژی ضروری است . این هند بوک که از اطلاعات و مثال های فراوانی تشکیل شده است ، برای هموار شدن مسیر تخلیص پروتئین ها تهیه شده است . گوناگونی مراحل تخلیص پروتئین از یک ته نشینی ساده تک مرحله ای ، تا یک پروسه معتبر لارج اسکل (Large Scale) ، می تواند باشد . اما اغلب ، بیشتر از یک مرحله برای رسیدن به خلوص مورد نظر ، برای تخلیص پروتئین ها مورد نیاز است .
کلید موفقیت و مؤثر بودن یک تخلیص ، در انتخاب کردن و برگزیدن از بیشترین تکنیکهای مناسب ، بالا بردن کارآیی توسط جور کردن ملزومات ، و آمیختن آنها در یک راه منطقی ، که مستلزم حداقل تعداد مراحل و حداکثر محصول است . در بیشتر طرحهای خالص سازی ، مبحث یکی از انواع کروماتوگرافی به میان می آید . چنانچه در هر آزمایشگاه تخلیص پروتئین ، ابزار کروماتوگرافی بسیار ضروری است . تکنیک های مختلف کروماتوگرافی با انتخاب پذیری های متفاوت ، می تواند ترکیب قدرتمندی را برای تخلیص هر بیومولکول ایجاد نماید . توسعه تکنیک های recombinant DNA انقلابی در تهیه پروتئین ها در مقیاس بالا می باشد . پروتئین های recombinant اغلب با روش راحت تری تولید می شوند ، اما بعد از تولید ، نوبت مرحله تخلیص به روش کروماتوگرافیست و این روش هنوز در همه تولیدات ، کاربردی است . گروههای آلوده کننده و مشکلات مربوط به انحلال آنها، ، حفظ ساختمان بی عیب و فعالیت بیولوژیکی مواردی است که باید ملاحظه شود .
اگر چه در آن ممکن است پارامتر های فراوانی ظاهر شود ، که باید ملاحظه شود ، اما با تعدادی راهنمایی ساده و همچنین به کارگیری سه مرحله در استراتژی تخلیص ، فرایند می تواند به صورت ساده و راحتی طراحی و انجام شود . این امر ممکن نیست مگر با دانستن اصول بنیادی و تفصیل تکنیکهای کروماتوگرافی .
ادامه مطلب مخصوص اعضاء
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در سه شنبه 18 دی 1389برچسب:تخلیص پروتئین ها,
در ساعت9:5 | |
پروتئومیکس و معالجه بیماری های صعب العلاج
آنالیز ، تخلیص و شناخت پروتئینها ، که هر کدام از آنها وظیفه ای خاص دارند ، باعث می شود ، بشر در آینده نزدیک کارهایی بتواند انجام دهد که نظیر نداشته باشد و تا به حال قادر به انجام آن نشده است . یکی از این کارها ، در زمینه پزشکی و ساخت دارو ها و معالجه بیماران صعب العلاج است . همانگونه که می دانیم بسیاری از بیماری ها به دلیل عدم سنتز یک ، یا چند نوع پروتئین است ، که خود این عدم سنتز می تواند علت های خاصی داشته باشد . هورمونها و آنزیم ها و مولکولهای مهمی ، که عدم وجود آنها ، مشکلات فراوانی را سبب می شود . پروتئومیکس در تشخیص این پروتئین ها کمک شایانی انجام می دهد . مثلا تشخیص پروتئین هایی که فقط در سلول های سرطانی تشکیل می شود ، و در سلولهای سالم دیده نمی شود . یا در تشخیص پروتین هایی که وجود و یا عدم وجود آنها ، در مغز یک انسان ، مشکلات خاصی مانند ms و عقب ماندگی های ذهنی و نظایر آنها ، ایجاد میکند . این رشته می تواند به پزشکان در ایجاد راهکارهایی برای درمان این نوع از بیماریها کمک کند . پزشکانی که روحیه تحقیق داشته باشند ، می توانند ایده های خوبی را دنبال کنند ، که فقط راه رسیدن به تحقق آنها ، پروتئومیکس و ژنومیکس است .
به عنوان مثال ، می توان سلول های مغز یک انسان عقب افتاده ذهنی را ، با سلول های مغز یک انسان سالم ، مقایسه کرد ( این بیماریها که اکثرا تا به حال ، لا علاج و ژنتیکی هستند ، بسیار جای کار دارند ) . این کار فقط با روش الکتروفورز 2 بعدی امکان پذیر است . اگر بیماری فرد ، به خاطر عدم سنتز یک یا چند نوع پروتئین باشد ، اگر بتوانیم این پروتئین ها را تهیه و تخلیص کنیم و یا به صورت مصنوعی ، یا روش های ژنومیکس سنتز کنیم و آنگاه ، به سلول برسانیم ، در حقیقت کلید حل این بیماری را یافته ایم و گام بزرگی را برداشته ایم .
نویسنده : ابوذر عسکری
9/10/1389
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در دو شنبه 9 دی 1389برچسب:پروتئومیکس,
در ساعت2:24 | |
راهنمایی های کلی در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز 2 بعدی (2DE)
روش آماده سازی نمونه علاوه بر کارآمد بودن ، باید تکرار پذیری نیز داشته باشد . این نکته بسیار مهم است . در نمونه سازی ممکن است از مواد زیادی مانند دترجنت ها ، عوامل کائوتروپیک و عوامل احیا کننده استفاده شود . در هر حال بهینه کردن روش آماده سازی نمونه به صورت تجربی صورت می پذیرد . اما موارد زیر را می توان در نظر داشت .
1- به حداقل رساندن مراحل آماده سازی نمونه :
افزایش مراحل آماده سازی نمونه اگر چه در مواردی موجب بهبود کیفیت نمونه می گردد ، اما اکثرا موجب هدر رفتن وقت و مواد و نیز از دست رفتن پروتئین ها می گردد .
2- ممانعت از توده ای شدن پروتئین ها :
پروتئین ها به هیچ وجه در نمونه و یا در مراحل بعد از الکتروفورز ، نباید رسوب و یا حلالیت آنها از بین برود .
3- خارج کردن اسیدهای نوکلوئیک و دیگر مولکولهای تداخل کننده :
مانند نمک ها و چربی ها و قند ها
4- حذف موادی که می توانند تولید ذره نمایند :
این مواد ( لیپیدها و مواد جامد ) باید از محیط نمونه خارج گردند .
5- محلول سازی تمام انواع پروتئین ها ( چه آبگریز و چه آبدوست ) :
باید تمام انواع پروتئین ها در محلول به صورت آزاد باشند ، یعنی تمام پیوند های غیر کووالان در کمپلکس ها و توده های پروتئینی از بین برود .
6- به حداقل رساندن تغییرات پروتئینی در نمونه :
مانند اثر آنزیم ها و اثر گرما
7- حذف پروتئین هایی که فراوانی زیادی در نمونه دارند :
این پروتئین ها ، دیگر پروتئین های نمونه را تحت پوشش می دهند.
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
جهت كاهش حجم و تغليظ و تخلیص پروتئينها , از روشهای مختلف رسوب دهی مانند رسوب دهی به وسيله نمك ، حلال های آلی و حلال های پليمری استفاده می شود .
رسوب دهی به وسيله نمك :
روش عمومی براي انجام عمل رسوب دهی استفاده از نمك است كه با افزايش مقدار نمك حلاليت پروتئينی كم شده و به هم پیوسته و رسوب می کند . قدرت رسوب دهی نمك ها , به صورت ذرات آنيوني و كاتيون در زیر نشان داده شده است .
از طريق هيدراته شدن یونهای مثبت و منفی نمك افزوده شده در محلول و دور كردن مولكولهای آب از سطوح هيدروفوب پروتئينها و درنتيجه اين سطوح هيدروفوب به هم پيوسته و رسوب می نمایند .
رسوب دهی به وسيله حلال های آلی :
با افزايش حلال آلی ، قدرت حلاليت مولكولهای باردار آب دوست پروتئينها در محيط آبی كم شده و باعث به هم پيوستن ذرات مولكولی و رسوب دهی آنها می شود . ( مانند مكانيزم رسوبدهی پروتئين ها در نقطة ايزوالكتريك , در غلظتهای پايين نمك) . به عنوان مثال اتانل , در جداسازی پروتئينهاِی پلاسمایی بسيار مورد استفاده قرار مي‌گيرد .
رسوب دهی به وسيله پليمرهای آلي :
این روش , مانند روش استفاده از حلال آلی و از طريق كاهش فعاليت محيط آبی است. به عنوان مثال Poly Ethylen Glycol , در جداسازی پروتئينهاِی پلاسمایی , فراوان مورد استفاده قرار مي‌گيرد .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
C : محلول 0.2 M سدیم هیدروکساید (Sodium Hydroxide)
D : محلول 4% w/v سدیم کربنات (Sodium Carbonate)
این محلول ها را در دمای اتاق می توان نگهداری نمود .
E : به 49ml از محلول 49ml , C محلول D اضافه کنید . سپس 1.0ml از محلول A به آن اضافه کرده , و بعد 1.0ml محلول B به آن اضافه کنید و نام آن را محلول E می گذاریم . این محلول در صورت نیاز باید به صورت تازه تهیه گردد .
F : به 10ml از محلول 10ml Folin-Ciocalteau آب اضافه می کنیم .
به 0.5ml از نمونه ای که حداکثر محتوی 0.5mg پروتئین است , 2.5ml از محلول E اضافه می کنیم .
خوب مخلوط کرده و 10min صبر می کنیم .
سپس به آن 0.25ml از محلول F اضافه می کنیم .
خوب مخلوط کرده و 30min صبر می کنیم .
جذب نمونه را در 750nm بخوانید . ضمنا بلنک (blank) تشکیل شده از 0.5ml آب مقطر که به آن مثل مراحل قبل 2.5ml محلول لوری اضافه شده است .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
برای درست کردن محلول بیوره باید 1.5g سولفات مس ( CuSO4.5H2O ) و .6.0g سدیم پتاسیم تارتارات را در 500ml آب مقطر حل نمود . سپس به آن 300ml سدیم هیدروکسید 10% (NaOH 10% w/v ) اضافه کرده , حجم آن را به 1lit می رسانیم . محلول را در ظرف پلاستیکی و در جای تاریک نگهداری نمایید .برای اینکه محلول را برای مدت زیادی نگهداری کنید , می توانید 1.0g پتاسیم یداید ( Potassium Iodide ) به آن اضافه کنید , تا مانع احیای مس شوید .برای 0.5ml از یک نمونه که ماکزیمم 3.0mg پروتئین داشته باشد , از 2.5ml محلول بیوره استفاده کنید . بعد از این کار باید 30min به آن فرصت دهید تا واکنش انجام شود .جذب نمونه را در 540nm بخوانید . ضمنا بلنک (blank) حاوی 0.5ml آب مقطر بعلاوه 2.5ml محلول بیوره می باشد .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)
روز بخير كاربر مهمان! 
